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プロテオーム解析による分子プロファイリング

(担当:長田裕之、室井 誠)

支援依頼者から提供された被検化合物を細胞に処理し、2D-DIGEを用いてプロテオームの変動を解析し、多変量解析を用いて作用点の明らかな化合物と比較することによって作用点を予測する。具体的には、これまでの研究で、HeLa細胞に化合物を処理した場合、化合物の作用機作に応じてプロテオームの特徴的な変化があらわれることを明らかにしている。化合物処理HeLa細胞について2次元電気泳動を用いたプロテオーム解析を行い、プロテオーム解析で得られたタンパク質スポットの定量値より多変量解析を用いて化合物間の類似度を算出し、当該化合物の作用を推定する。それに加え、化合物処理で特徴的に変化したタンパク質スポットの情報を基に、化合物の作用するパスウェイを推定・評価する。

ただし、HeLa細胞を用いるため、HeLa細胞に標的がない場合や、プロテオームの変化が十分に認めらない場合には評価が難しい。

【方法】

HeLa細胞を培養用シャーレ(6 cm径)にまき込み、翌日サンプルを添加、18時間培養後、回収した細胞を可溶化、2D-DIGEのシステムを用いて296スポットの定量を行う。同時に調製した化合物未処理のコントロールから得られた定量値に対する増減の比を計算し評価に用いる。化合物濃度はHeLa細胞を48時間処理したときにHeLa細胞の増殖を80%以上阻害する濃度で行う。

【化合物の評価】

得られたスポットの増減値を、これまで測定したデータベース化した80化合物と比較するために、多変量解析を用いて類似度を計算し、サンプルの作用機作の推定、あるいは、新規性の評価を行うとともに、顕著に増減の認められたスポットを抽出し、特定のパスウェイに及ぼす作用を評価する。

【欲しい情報】

有効濃度や処理時間

【参考文献】

  1. 室井 誠, 長田裕之 “大規模プロファイリングを用いた標的同定”, CSJ Current Review 生物活性分子のケミカルバイオロジー 標的同定と作用機構, 71-78 (2015)
  2. Muroi M, Futamura Y, Osada H. “Integrated profiling methods for identifying the targets of bioactive compounds: MorphoBase and ChemProteoBase.” Nat. Prod. Rep. 33:621-5 (2016)
  3. Muroi M, Kazami S, Noda K, Kondo H, Takayama H, Kawatani M, Usui T, Osada H. “Application of proteomic profiling based on 2D-DIGE for classification of compounds according to the mechanism of action.” Chem. Biol. 17:460-70 (2010)

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